蛋白纯化实验过程中的一些技巧

蛋白质纯化新手有福利了，abebio就一些最常用的纯化工艺、概念方法作一些列举。 

大肠杆菌（这里指的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白）

        大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有实验朋友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我司在做蛋白纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。

        在这个问题方面，我想说一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？

        说这个问题主要在于有些实验朋友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达，甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。

        其实对于我司来说，关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。

        我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。做过蛋白QC的朋友都清楚，20%的条带要它变成30%又有何难？

        我司在对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。

（1）破菌前处理

        诱导表达的菌体在发酵离心后，最好先用PBS缓冲液或其它缓冲液立即洗涤一次。菌体洗涤可以去除一些培养基中的杂质，及代谢产物，减少对后续纯化的影响。如果菌体已经冻存过，冻融的菌体可能有部分破碎，就不要洗涤菌体了。

小量菌体的悬浮可以用5ml的枪头吹打，再磁力搅拌。大量菌体的悬浮可以用分散乳化机。破菌缓冲液的用量一般为1∶10—1∶20，即1g湿菌体用10—20ml的破菌缓冲液。

（2）破菌缓冲液的选择

        选择何种破菌缓冲液，应该与后续的纯化方法密切相关，不能一刀切。而且，破菌缓冲液还与是否可溶表达相关。对于可溶表达的重组蛋白，一般就选用第一步层析纯化的平衡缓冲液为破菌缓冲液。对于不可溶表达的重组蛋白，最简单的就是选用PBS为破菌缓冲液。

在选用破菌缓冲液时，有个小小的trick，加EDTA。有个别重组蛋白很脆弱，在超声破菌时就有大量的降解。注意，不是表达降解，而是超声过程中降解。特别是用pET32表达的his-tag融合蛋白容易降解。

（3）破菌方法

        大肠杆菌的破碎方法常用的大概有：反复冻融加溶菌酶法、超声法和压力匀浆法。一般来说处理菌体的量也是这个顺序。我司选择用强力型的超声和压力匀浆。超声法是小规模和中等规模破碎菌体的首选，选择好相应的超声探头，一次处理菌体量为0.1g-100g。压力匀浆为中到大规模破菌的首选，处理量大、快，破菌效果好，但发热量大，对温度非常敏感的蛋白慎用。

        超声破菌：以10g湿菌体为例，加入破菌缓冲液100ml，玻璃烧杯中磁力搅拌悬浮充分。冰水浴超声。设置超声时间4s，间隙时间4s，超声功率400-600W，超声次数100-200次。

        压力匀浆：以200g湿菌体为例，加入4℃预冷的破菌缓冲液3000ml，用分散乳化机充分混匀。匀浆压力800bar左右，压力匀浆发热非常大，流出液要冰水浴加磁力搅拌。一次匀浆完毕后，让菌液充分冷却后再进行二次匀浆。匀浆完毕的菌液如果粘度比较大，可用超声破碎仪超声40次，打碎核酸减小粘度，以方便离心和纯化。

（4）破菌后离心

        高速冷冻离心机离心，50ml的小管18000rpm，20min，4℃；500ml的瓶用10000rpm，30min，4℃。50ml小管的离心效果比500ml的瓶好。

（5）过滤

        对上清可溶表达的蛋白在收集破菌离心上清后，必须过滤后才能上柱纯化。过滤一般采用真空负压抽滤，可以选择0.8um的膜或双层滤纸过滤。多数层析的要求都是过柱溶液需经过0.45um的膜过滤，但实际上对破菌后的上清液或包涵体的溶解上清样，0.45um膜太难过滤了，无法完成操作。所以我司采用双层滤纸或0.8um的膜过滤。

（1）包涵体洗涤

        用什么溶液来洗涤包涵体也是与后续纯化方法相关的。例如，后面接离子交换层析，洗涤液不能加盐；后面接Ni柱，洗涤液不能加EDTA等等。

        pH6.0-pH9.0：高pH使得包涵体倾向于溶解，杂蛋白也去除的好些，但高pH有可能使目的蛋白降解。

        10-50mM PB，10-50mM Tris：维持缓冲环境，后接离子交换时选低一点的浓度。

        0-0.5N NaCl：盐洗涤有助于核酸的去除，盐洗涤后包涵体的OD280/260的比值（溶解后）会升高很多，也就是核酸去除很多，有利于后续纯化。

        0.5-5mM DTT：提供还原环境，打开蛋白中的二硫键，使得包涵体倾向于溶解，有利于杂蛋白的去除。但浓度太高了使得包涵体真的溶解就不是洗涤了。后续用Ni-IDA柱不可以加，用Ni-NTA柱少加。

        0-1%beta-ME：同DTT，还原能力稍弱。

        0-2N Urea：变性剂，有利于包涵体中氢键、疏水键、范德华力……的打开，有利于洗涤去除杂蛋白。同样高浓度会使包涵体溶解。

        0.05-1%Triton X100：非离子型表面活性剂，如同洗衣粉一样的效果。

        0-2mM EDTA：螯合剂，去除金属离子，有利于蛋白的稳定和溶解。Ni柱禁用。