细胞培养常见问题

       要冷藏！！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6~12个月。 

       几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 ◦C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ◦C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1 mL/支）。每支1 mL的谷氨酰胺加到99 mL完全培养基中，其终浓度为2mM/mL培养基。包装为粉红色，-24◦C保存。 

       由于，大多数细胞适宜pH为7.2~7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。 

       但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。因此，我们在配制培养用液时，可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10μm或0.22μm滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。 

培养基名称             渗透压范围（mOSM） 

DMEM（高糖）     315 ~ 350 

DMEM（低糖）     270 ~ 330 

RPMI-1640            260 ~ 290 

MEM-EBSS            280 ~ 310 

MEM-NEAA           280 ~ 310 

McCoy5a               280 ~ 310 

MEM-a                  280 ~ 310 

M-199                   275 ~ 305 

IMDM                    270 ~ 300 

DMEM/F-12          280 ~ 310 

F-10                       270 ~ 300 

F-12                       275 ~ 300 

L-15                       280 ~ 320 

D-Hanks                280 ~ 300 

Hanks                    280 ~ 300 

PBS                        275 ~ 300 

5. 细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？ 

       不见得！因为胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca++, Mg++离子和血清等因素有关。通常情况下，pH 8.0 , 温度 37 °C其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。本中心通常使用的消化液浓度为： 

（1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％ EDTA;

（2）0.25％胰蛋白酶＋0.03％ EDTA; 

（3）0.25% 胰蛋白酶。 

溶液pH 8.0～9.0；使用D-Hank液配制。 

多数细胞传代消化可使用0.05％胰蛋白酶＋0.02％ EDTA这种消化液。  

  

（1）培养基在使用前需37 ◦C预热或在室温平衡后再使用。 

（2）细胞培养过程中，吸取过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，防止残留在吸管内的培养基焦化，将有害物质带入培养液中。 

（3）尽量缩短各种液体、细胞的暴露时间。 

（4）避免液体间、细胞间的交叉污染。 

（5）配制完全培养基时，配制的量最好在2周内用完为好。 

  

新生牛血清：新出生牛5天内取血制成 

小牛血清：小牛出生16周以内采血制成。 

胎牛血清：（进口血清）要求剖腹取胎制成。 

国内厂家往往不能做到，经常把出生2天以内采血称为胎牛血清。 

根据血清的生产工艺及血红蛋白、内毒素含量又分为： 

（1）特级胎牛血清：40nm过滤，内毒素含量≤10EU，血红蛋白含量≤10mg/dL。 

（2）优等胎牛血清：经过3次100nm过滤，内毒素含量≤25EU/mL，血红蛋白含量≤25mg/mL。 

（3）标准胎牛血清：3次100nm过滤，低内毒素，低血红蛋白含量。 

（4）活性碳/葡聚糖处理血清：激素含量大大降低。 

（5）透析型胎牛血清：次黄嘌呤和胸腺核苷含量大大降低。 

  

8. 其他细胞培养用液：除培养基、血清、谷氨酰胺外，其他几种液体也属必须，不可省略。 

（1）双抗：200倍，（1 mL/支）其终浓度为青霉素100U/ mL；链霉素100μg/mL，-24 °C保存。 

（2）L-谷氨酰胺：100倍（1 mL/支）， 终浓度2 mM，-24 °C保存。 

（3）丙酮酸钠：配制浓度50 mM，4 mL/支，终浓度为1 mM/mL， -24 °C保存。 

（4）Hepes液：配制浓度1M（5 mL/支），一支Hepes加入到200 mL完全培养基中，终浓度为25 mM/mL，常温保存。 

  

（1）支原体污染在细胞培养中最常见、不易被查觉，但支原体污染可显著影响细胞功能干扰实验结果。支原体是介于细菌和病毒之间的目前所知能独立生活的最小微生物，它无细胞壁，形态呈高度多形性，最小直径0.2μm，可通过滤器。 

       目前中心通过对国内100余株/系细胞的检测，形势不容乐观。污染率达30% ~ 60% 。课题组从国外引进细胞株/系也经常出现支原体的污染。支原体在污染细胞后，它通过影响细胞的DNA、RNA 的合成及急速消耗培养基中的氨基酸来抑制细胞的生长，并能降低细胞的融合率。因此，在运用各种细胞系进行实验研究时，首先要证明所用细胞有无支原体的污染。 

（2）支原体污染后，培养基可不发生浑浊，细胞病变轻微或不明显，因此难以发现。目前，支原体检测的方法有以下几种。 

（a）相差显微镜观察；

（b）低张处理地衣红染色法； 

（c）荧光染色法；

（d）酶标法； 

（e）PCR法：基础医学细胞中心使用该方法进行检测。 

优点：灵敏度高，检测耗时短，样品量小 （只需50 μL细胞培养用液上清）。 

缺点：引物及制剂费用较高。