本文简明扼要的介绍了盐析法、冷酒精沉淀法、Deae-sephadex a-50柱层析法、SPA-sepharose cl-4b亲和层析法及高效和液相色谱纯化单克隆抗体的原理、材料、器材和具体操作步骤，简单明晰，可操作性和实用性较强。
一、盐析法
精制抗体的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。例如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
原理：
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白分子之间聚集而沉淀。
主要材料
1.试剂：
(1) 正常人混合血清；灭菌生理盐水。
(2) 饱和硫酸铵溶液的配制
称(NH4)2SO4(AR) 400-425g，以50-80°C之蒸馏水500 mL溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水调pH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
(3) 奈氏试剂配制
称HgI 11.5g，KI 8g，加蒸馏水至50 mL溶解，搅拌溶解后，再加入20% NaOH 50 mL。
(4) 0.02M，pH 7.4 磷酸盐缓冲盐液(PBS)配制：
A 液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64g，加蒸馏水至1000 mL
B 液：0.2M NaH2PO4：NaH2PO4·2H2O 3.12g，加蒸馏水至1000 mL
应用液：取A液81 mL加B液19 mL混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。
(5) 20%磺基水杨酸
2.器材
普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751型紫外分光光度计、扭力天平、粗天平、透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密pH试纸(pH 5.5-9.0)、眼科镊子、小剪刀、烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。
实验操作
取1X mL血清加1X mL生理盐水，于搅拌下逐滴加入2X mL饱和硫酸铵，硫酸铵的饱和度为 50%。放置于4°C，3小时以上，使其充分沉淀
离心(3000rmp)，20分钟，充上清，以X mL 生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵 X/2 mL。
置于4°C 3小时以上，(此时，硫酸铵的饱和度为33%)
重复上述第二步过程1-2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02M pH 7.2 PBS溶解至X mL装入透析袋。
对PBS充分透析、换液3次，至奈氏试剂测透析外液无黄色，即无铵离子为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以752型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
1. 蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉淀作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
2. 离子强度：各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分不同，饱和度为50%时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33%时γ球蛋白析出。
3. 盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子
3.1 pH值：一般来说，蛋白质所带静电荷越多，它的溶解度越大。改变pH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
3.2 温度：盐析时温度要求并不严格一般可在室温下操作。血清蛋白于25°C时较0°C更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
3.3 蛋白质沉淀后宜在4 °C放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
二、冷酒精沉淀法
分离过程如下：
(1) 血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7冷却到0°C。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精(-20°C)到最终浓度为20%，保持在-5°C。产生的沉淀(A)，含有大多数种类的免疫球蛋白。
(2) 沉淀A悬浮于25倍体积的0.15-20M NaCL溶液(冷)中，加有0.05M醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀(B)，包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。
(3) 调节上清液的pH到7.4，加冷酒精(-20-30°C)到最终浓度为25%，维持在-5°C。所得到的的沉淀(C)含有90%-98% IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。
(4) 从沉淀(B)可按照下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀(B)悬浮在0°C水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01-0.0075，pH 5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在-2°C或-3°C低温，所得到的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。
表：从几种动物和人血清和沉淀A分离IgM的条件
三、Deae-sephadex a-50 柱层析法
原理：
Deae-sephadex a-50(二乙胺基-乙基-葡萄糖凝胶a-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将氯离子转变为碱离子型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH 6.85-7.5)，其余均属酸性蛋白。pH 7.2-7.4的环境中，酸性蛋白均被Deae-sephadex a-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG。
试剂和器材
1.试剂
(1) 盐析提取的人γ球蛋白
(2) 0.5M NaOH，0.5M HCl，2M NaCL，10% NaN3
(3) Deae-sephadex a-50，聚乙二醇(PEG)
(4) 0.1M，PH 7.4 PBS
2、器材
(1) 层析玻璃柱(1.3*40 cm)，滴定铁架，自由夹，螺旋夹，尼龙纱(200目)
(2) 普通冰箱，751型紫外分光光度计，电导仪，抽滤装置(包括抽气机、干燥瓶、布氏漏斗、橡皮垫圈、抽滤瓶)，PH计
(3) 透析袋，坐标纸，滤纸，pH精密试纸
(4) 量筒，烧杯，试管，吸管，滴管，灭菌小瓶等。
操作步骤：
1. Deae-sephadex a-50预处理
称 Deae-sephadex a-50(下称a-50) 5g，悬于500 mL蒸馏水内，1小时后倾去上层细粒。按每克 a-50加0.5M NaOH 15 mL的比例，将a-50浸泡于0.5M NaOH 溶液中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水洗至PH呈中性；再以0.5M NaOH 再处理一次。处理完后，将a-50浸泡于0.1M PBS中过夜。
2. 装柱
(1) 将层析垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。
(2) 将0.1M pH7.4 PBS沿玻璃棒倒入柱中至四分之一高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的a-50。等a-50凝胶沉降2-3 cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1 mL每
分钟，同时连续倒入糊状a-50凝胶至所需高度。
(3) 关闭出水口，待a-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。
3. 平衡
启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应小于床体积2%，蛋白浓度以小于100 mg为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2-3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12-14滴每分钟。
4. 收集
开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3-5 mL。共收集10-15管。
5. 测蛋白
以751型紫外分光光度计分别测定每管OD值280 nm，与OD值260 nm，按公式计算各管蛋白含量。并以OD 280 nm为纵坐标，以试管编号为横坐标，绘制洗脱曲线。
6. 合并浓缩
将洗脱峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG (mw6000)浓缩至所需体积，加入0.02% NaN3防腐，于4°C保存时应贮于-40°C冰箱中。
7. a-50 凝胶的再生
在柱上先以2M NaCl洗脱蛋白至流出液的OD值280小于0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将a-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4°C保存；近期不用时，以无水乙醇洗2次，再置50°C温箱烘干，装瓶内保存。
注意事项
(1) 柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。
(2) 纯化过程必须严格控制缓冲液的PH及离子强度。样品与a-50凝胶必须用洗脱液彻底平衡后，才能进行柱层析。
(3) 所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。
(4) 洗脱过程应严格控制流速，切勿过快。
(5) 上样的体积要小，浓度不易过高。
(6) 加样及整个洗脱过程中严防柱面变干。
四、SPA-sepharose cl-4b亲和层析法
原理
葡萄球菌a蛋白(SPA)具有多种哺乳动物IgG分子fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-sepharose cl-4b柱上的IgG或不同的IgG 亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
试剂器材
(1) SPA-sepharose cl-4b
(2) 磷酸缓冲液0.1M pH 8.6 加入0.02% NaN3
(3) 枸橼酸缓冲液
0.1M pH 5.5 加入0.02% NaN3
0.1M pH4.0 加入0.02% NaN3
0.1M pH 3.0 加入0.02% NaN3
(4) 1M pH 9.0 tris-HCl
(5) 再生缓冲液
① 0.1M tris 含0.5M NaCL调整至pH 8.6 加入0.02%NaN3
② 0.1M醋酸钠含0.5M NaCL调整至pH 2.2 加入0.02% NaN3
操作步骤
用0.1M pH8.6磷酸缓冲液浸泡SPA-sepharose cl-4b凝胶，13分钟。按1g干胶200 mL上述缓冲液充分洗涤凝胶(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。
装柱后用0.1M pH 8.6磷酸缓冲液平衡。
标本可用硫酸铵粗提物，先10,000g 离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用 1M pH 9.0 tris-HCL液调整标本液pH至8.6或对平衡液透析过夜。
加样，一般按25-30 mg IgG/g 湿胶比例加样，室温作用15分钟，用0.1M pH 8.6磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为小于0.02。
用不同PH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20 mL每小时。如纯化小鼠IgG1一般用pH 5.5，纯IgG2a用pH 4.0；纯化IgG2b用pH 3.0
用②再生缓冲液洗脱剩余蛋白，洗脱后用①再生缓冲液平衡完成再生
收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。
注意事项
(1) SPA-sepharose cl-4b凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10-20次左右。
方法：先用10倍柱体积0.1M pH 8.6 tris含0.5M NaC溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1M pH 4.5 醋酸钠缓冲液含0.5M NaCL溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1M pH 8.0 磷酸缓冲液平衡，4°C贮存。
(2) SPA-sepharose cl-4b亲和层析法还可用于；①除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。
(3) 狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgM和IgA也具有与SPA结合的能力。
五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体
从小鼠腹水中纯化mcab的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。应用tsk deae-spw 离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化mcab不仅纯化速度快，回收率和得率高，而且保持良好的生物学活性。
原理
根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含mcab γ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。
试剂和器材
(1) tsk deae spw离子交换层析柱
(2) 高效液相色谱(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280 nm监测系统)
(3) PBS，缓冲液a和b。
操作步骤
腹水离心10,000g，10分钟，除去细胞和杂质，在4°C下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵；
搅拌20-30分钟；
离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液a (pH 8.5，20 mM tris缓冲液)透析除盐；
4°C过夜；
用带有1000 μL样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样与经缓冲液a液平衡的tsk deae spw离子交换层析柱；洗脱液流速1 mL每分钟；
0-1分钟：0-5%缓冲液b (20 mM tris, pH 8.5，含2.0M醋酸钠)；
1-2分钟(线性梯度洗脱)：5-20%缓冲液 b；
20-22分：20-0%缓冲液b；
洗脱液用紫外280 nm进行监测；收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定。
注意事项
(1) 所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤
(2) 在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12分钟。但不同类和亚类抗体以及不同特异性mcab的存留时间有所差异。
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